Наукові доповіді Національного університету біоресурсів і природокористування України

Вплив біотехнологічних процедур трансгенозу на виживаність ембріонів свійської качки

П. Король, Світлана Костенко, О. Коновал, М. Дорошенко, Л. Лу, А. Чепіга, О. Сидоренко, Павлина Джус, Наталія Свириденко, Т. Литвиненко, Х. Сюетао, Л. Лі, Є. Костюк, П. Філіпова, M. Драгулян
Завантажити статтю
Анотація

Завдяки високому репродуктивному потенціалу, короткому інтервалу між поколіннями та ембріональному розвитку поза організмом матері, птиця характеризується унікальними можливостіями для її використання у фундаментальних та прикладних біологічних дослідженнях. Створення трансгенної птиці ускладнюється будовою її непрозорої яйцеклітини з великим жовтком та унікальною репродуктивною системою цього класу. До цього часу методи створення гермінтативних химер качок стикаються з труднощами, пов'язаними зі структурою шкаралупи водоплавних птахів. Тому метою роботи було встановлення дії чинників, які впливають на виживаність трансгенних ембріонів за використання різних методів введення ДНК-конструкції в геном качки. Об’єктами дослідження були качки (Anas platyrhynchos) порід шанма (Shan partridge) та шаосінь (Shaoxing), що утримуються на фермі Zhejiang Guowei Technology Co. LTD, КНР. Дослідження проводили в лабораторії генетики птиці Чжецзянської Академії аграрних наук та на качиній фермі компанії Zhejiang Generation Biological Science and Technology Co., Ltd. (провінція Чжецзян, КНР). Для аналізу виживаності використовували ембріони, отримані за використання різних методів введення ДНК трансгенної конструкції: 1) пряма ін’єкція плазмідної-ДНК у підембріональну порожнину; 2) трансфекція ДНК зі спермою; 3) ін‘єкція трансфікованих бластомерів донорів в ембріони реципієнтів після дії бусульфану або ультрафіолету. За весь період було досліджено понад 1100 яєць. Наявність трансгену перевіряли методом ПЛР. У результаті дії прямої ін‘єкції ДНК трансгенної конструкції під ембріональну порожнину 300 ембріонів 35,7 % ембріонів не розвивалися після ін‘єкції, 36,0 % зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії (9 день інкубації), 8 % загинули в період 10–15 днів, 17,3 % – 16–25 день. Усього після прямих ін’єкцій отримали 9 живих каченят (виживаність склала 3 %), серед яких 4 були трансгенними. Після осіменіння качок трансфікованою спермою на інкубацію було закладено 292 яйця. Після першої овоскопії незаплідненими виявилися 51,4 % яєць; 0,7 % ембріонів зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії, 1,0 % загинули в період 10–15 днів, 17,8 % – 16–25 день, 6,2 % задихнулися під час виводу. Усього після використання трансфікованої сперми отримали 67 живих каченят (виживаність ембріонів від запліднених яєць склала 47,2 %). Поміж 31 дорослої тварини 19 були трансгенними. Для стерилізації клітин реципієнта за використання бусульфану у концентрації 300 нг на яйце з подальшою ін‘єкцією бластодермальних трансфікованих клітин донорів дослідили 200 ембріонів, серед яких не розвивалися після ін‘єкції 61,0 % ембріонів, 17,0 % зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії, 12,5 % загинули в період 10–15 днів, 9,0 % – 16–25 день. Усього після ін’єкцій бусульфану у концентрації 300 нг на яйце отримали 1 живе каченя (виживаність склала 0,5 %). За використання бусульфану в концентрації 150 нг на яйце дослідили 100 ембріонів, поміж яких не розвивалися після ін‘єкції 68,0 % ембріонів, 11,0 % зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії, 5 % загинули в період 10–15 днів, 14,0 % – 16–25 день. Усього після ін’єкцій бусульфану у концентрації 150 нг на яйце отримали 2 живих каченят (виживаність склала 0,5 %). Використання бусульфану в концентрації 75 нг на яйце випробували на 100 ембріонах, серед яких не розвивалися після ін‘єкції 12,0 % ембріонів, 27,0% зупинилися в розвитку на момент першої овоскопії, 14,0 % загинули в період 10– 15 днів, 42,0 % – 16–25 день. Усього після ін’єкцій бусульфану у концентрації 75 нг на яйце отримали 5 живих каченят (виживаність склала 5 %). Опромінення ультрафіолетом 200 ембріонів упродовж 1 години з подальшою ін‘єкцією бластодермальних трансфікованих клітин донорів призвело до загибелі після ін‘єкції 20 %, зупинились у розвитку 27,5 %, 7,5 % загинули в період 10–15 днів, 35,0 % – 16–25 день. Усього за використання ультрафіолетового опромінення отримали 20 живих каченят (виживаність склала 10 %). Після настання статевої зрілості лише 13 з 20 тварин дали потомків. Аналіз ДНК, виділеної з крові, пір‘я, сперми, засвідчив, що з цих 13 репродуктивно здатних особин 7 були трансгенними химерами. Використання ультрафіолету дозволило зменшити вплив інфікованості яєць, яка обумовлена структурою шкаралупи водоплавної птиці. Таким чином, самим безпечним для виживання ембріонів виявився метод осіменіння качок трансфікованою спермою, за використання якого вижили 47,2 % ембріонів

Ключові слова

Anas platyrhynchos, качка свійська, трансгеноз, виживаність ембріонів, трансфекція ДНК зі спермою, ін’єкції бластомерів, бусульфан, опромінення ультрафіолетом

ЦИТУВАТИ
Korol, P., Kostenko, S., Konoval, О., Doroshenko, М., Lu, L., Chepiha, А., Sydorenko, О., Dzhus, P., Svyrydenko, N., Lytvynenko, Т., Xuetao, Х., Lu, L., Kostyuk, Е., Filipova, P., & Drahulian, M. (2021). Transgenesis biotechnological procedures influence on domestic duck embryos survival. Scientific Reports of the National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, 17(4),55-71. https://doi.org/dopovidi2021.04.006
Використані джерела
  1. Kagami, H. (2016). Perspectives on avian stem cells for poultry breeding. Animal Science Journal, 87(9), 1065-1075. https://doi.org/10.1111/asj.12620.
  2. Mozdziak, P.E., & Petitte, J.N. (2004). Status of transgenic chicken models for developmental biology. Developmental Dynamics, 229(3), 414-421. https://doi.org/10.1002/dvdy.10461.
  3. Tjørve, K.M., & Tjørve, E. (2010). Shapes and functions of bird-growth models: How to characterise chick postnatal growth. Zoology, 113(6), 326-333. https://doi.org/10.1016/j.zool.2010.05.003.
  4. Lampreht Tratar, U., Horvat, S., & Cemazar, M. (2018). Transgenic mouse models in cancer research. Frontiers in Oncology, 8, 268. https://doi.org/10.3389/fonc.2018.00268.
  5. Pavlou, A., & Reichert, J. (2004). Recombinant protein therapeutics—success rates, market trends and values to 2010. Nature Biotechnology, 22, 1513-1519. https://doi.org/10.1038/nbt1204-1513.
  6. Lillico, S.G., McGrew, M.J., Sherman, A., & Sang, H.M. (2005). Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs. Drug Discovery Today, 10(3), 191-196. https://doi.org/10.1016/S1359-6446(04)03317-3.
  7. Devlin, R.H. (2011). Cellular, molecular, genomics, and biomedical approaches | Growth hormone overexpression in transgenic fish. Encyclopedia of Fish Physiology, 2016-2024. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-374553-8.00247-1.
  8. Clark, D.P., & Pazdernik, N.J. (2016). Transgenic animals. Biotechnology, 493-521. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-385015-7.00016-8.
  9. Gordon, J.W., & Ruddle, F.H. (1981). Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science, 214(4526), 1244-1246. https://doi.org/10.1126/science.6272397.
  10. Love, J., Gribbin, C., Mather, C., & Sang, H. (1994). Transgenic birds by DNA microinjection. Nature Biotechnology, 12(1), 60-63. https://doi.org/10.1038/nbt0194-60.
  11. Perry, M.M. (1988). A complete culture system for the chick embryo. Nature, 331(6151), 70-72. https://doi.org/10.1038/331070a0.
  12. Ginsburg, M., & Eyal-Giladi, H. (1987). Primordial germ cells of the young chick blastoderm originate from the central zone of the area pellucida irrespective of the embryo-forming process. Development, 101(2), 209-219.
  13. Kagami, H., Tagami, T., Matsubara, Y., Harumi, T., Hanada, H., Maruyama, K., et al. (1997). The developmental origin of primordial germ cells and the transmission of the donor-derived gametes in mixed-sex germline chimeras to the offspring in the chicken. Molecular Reproduction and Development, 48(4), 501-510. https://doi.org/10.1002/(sici)1098-2795(199712)48:4<501::aid-mrd11>3.0.co;2-w.
  14. Kino, K., Pain, B., Leibo, S., Cochran, M., Clark, M., & Etches, R. (1997). Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells. Poultry Science, 76(5), 753-760. https://doi.org/10.1093/ps/76.5.753.
  15. Chen, Y.C., Lin, S.P., Chang, Y.Y., Chang, W.P., Wei, L.Y., Liu, H.C., et al. (2018). In vitro culture and characterization of duck primordial germ cells. Poultry Science. https://doi.org/10.3382/ps/pey515.
  16. Sztán, N., Patakiné Várkonyi, E., Liptói, K., & Barna, J. (2012). Observations of embryonic cell manipulations in different poultry species. Magyar Allatorvosok Lapja, 134, 475-478.
  17. Aige-Gil, V., & Simkiss, K. (1991). Sterilisation of avian embryos with busulphan. Research in Veterinary Science, 50(2), 139-144. https://doi.org/10.1016/0034-5288(91)90096-7.
  18. Tahyrov, M.T. (2010). Production of chimeras of germinal line of poultry. Biotechnologia Acta, 3(2), 82-87.
  19. Kaewmanee, T., Benjakul, S., & Visessanguan, W. (2009). Changes in chemical composition, physical properties and microstructure of duck egg as influenced by salting. Food Chemistry, 112(3), 560-569. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.06.011.
  20. Korol, P.V., Kostenko, S.O., Konoval, O.M., Lu, L., & Li, L. (2019). Egg productivity of EGFP-transgenic ducks. Animal Science and Food Technology, 10(3), 20-26. https://doi.org/10.31548/animal2019.03.020.
  21. Doroshenko, M.S., Chepiha, A.M., Kostenko, S.O., Korol, P.V., Konoval, O.N., Lu, L., Xuetao, H., & Li, L. (2018). Influence of the reproductive season on the sperm production of the germline chimeras of drakes. Animal Breeding and Genetics, 55, 187-195. https://doi.org/10.31073/abg.55.26.
  22. Hamburger, V., & Hamilton, H.L. (1992). A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics, 195(4), 231-272. https://doi.org/10.1002/aja.1001950404.
  23. Eyal-Giladi, H., & Kochav, S. (1976). From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. Developmental Biology, 49(2), 321-337. https://doi.org/10.1016/0012-1606(76)90178-0.
  24. Lucas, A.M., & Jamroz, C. (1961). Atlas of Avian Hematology. Washington D.C.: US Department of Agriculture.
  25. Onishi, N., Kato, Y., & Futamura, K. (1955). Studies on the artificial insemination in ducks. Bulletin of the National Institute of Agricultural Sciences, Series G, 11, 1-16.
  26. Konoval, O., Korol, P., Tabaka, P., Kostenko, S., Lizhi, L., Chepiha, A., Doroshenko, M., Drahulian, M., Bu, X., Huang, X., & Li, L. (2019). Generation of transgenic ducks by CRISPR/CAS9-mediated gene insertion combined with the sperm-mediated gene transfer (SMGT). Biopolymers and Cell, 35(6), 427-436. https://doi.org/10.7124/bc.000A16.
  27. Jordan, B.J., Vogel, S., Stark, M.R., & Beckstead, R.B. (2014). Expression of green fluorescent protein in the chicken using in vivo transfection of the piggyBac transposon. Journal of Biotechnology, 173, 86-89. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.01.016.
  28. Penno, C.A., Kawabe, Y., Ito, A., & Kamihira, M. (2009). Production of recombinant human erythropoietin/Fc fusion protein by genetically manipulated chickens. Transgenic Research, 19(2), 187-195. https://doi.org/10.1007/s11248-009-9310-z.
  29. Scott, B.B., & Lois, C. (2005). Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(45), 16443-16447. https://doi.org/10.1073/pnas.0508437102.
  30. Wang, Z.B., Du, Z.Q., Na, W., Jing, J.H., Li, Y.M., Leng, L., et al. (2019). Production of transgenic broilers by non-viral vectors via optimizing egg windowing and screening transgenic roosters. Poultry Science, 98(1), 430-439. https://doi.org/10.3382/ps/pey321.
  31. Lee, H.J., Yoon, J.W., Jung, K.M., Kim, Y.M., Park, J.S., Lee, K.Y., et al. (2019). Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. https://doi.org/10.1096/fj.201802671r.